И. Ванденбюсс, Me ига SA, Бельгия
Цель разведения дрожжей в пивоваренной промышленности состоит в том, чтобы получить достаточно чистую культуру дрожжей в оптимальном физиологическом состоянии, чтобы при определенном количестве введенных дрожжей, составе сусла и температурном режиме дрожжи могли бы последовательно, на протяжении ряда поколений обеспечивать необходимое время брожения и требуемый профиль пива.
Кислород необходим для роста дрожжей. Естественно, что для хорошего размножения дрожжей очень важен и доступ кислорода, и эффективность его поглощения дрожжами. Хорошей передачи кислорода можно добиться при использовании мембранного разбрызгивателя замкнутой конфигурации. Первые результаты использования мембранного цикла разбрызгивателя для насыщения кислородом снятых дрожжей, представленные Машелейном и др. [1], показали эффективность подобной передачи кислорода. Давление, поддерживаемое внутри мембраны, направляет поток кислорода навстречу потоку дрожжевой суспензии.
Эта методика адаптирована и оптимизирована для разведения чистой культуры дрожжей в промышленном масштабе. В статье исследуются некоторые основные параметры процесса разведения (штамм дрожжей, температура, концентрация кислорода, значение аминного азота в сусле и число рециркуляции дрожжевой суспензии в мембране). При определенных условиях была получена концентрация дрожжей до 250 млн клеток/мл.
В результате можно утверждать, что при использовании мембранного разбрызгивателя доставка кислорода к клеткам дрожжей больше не является фактором ограничения их роста. Конечная концентрация дрожжей будет зависеть от присутствия достаточного количества субстрата в среде для выращивания.
2.1. Пивоваренные дрожжи: исторические сведения
Древнейшим дошедшим до нас достоверным сведениям о пивоварении приблизительно 6000 лет, и восходят они к шумерам. Шумеров, живших в Месопотамии, считают основателями традиции пивоварения. «Божественный напиток» был откры ими случайно и, разумеется, был признан даром богов. Поcле шумеров во II тысячелетии до н. э. властителями Месопотами стали вавилоняне. Из Вавилона пиво, а также сведения о пивоварении, попали в Египет. Египтяне внесли свой вклад в традицию пивоварения. Они использовали сырое хлебопекарное тестон для улучшения вкуса добавляли в пиво финики. О значении пива в древнем Египте можно судить по тому факту, что писцами был создан дополнительный иероглиф, обозначающий пивовара.
Проникновение в тайну процесса брожения началось во второй половине XVII столетия. Голландец Антони ван Левенгук описал микроскопические структуры, названные им «anima-сulеs».0ни получили название одноклеточных организмов после того, как Луи Пастер в 1876 г. издал свою работу «Этюды о пиве», которая заложила основы представлений о процессе брожения, принципах стерилизации и культурах дрожжей в пивоваренной промышленности. Вскоре после этого Эмиль Христиан Хансен успешно, выделил одиночную дрожжевую клетку и заставил ее размножаться в искусственной культурной среде. Хансен и Кюле разработали первый дрожжерастительный аппарат. Он состоял из суслоприемника и резервуара для разведения дрожжей (пропагатора), снабженного подводом стерильного воздуха и рабочим колесом. Основные принципы этой системы разведения дрожжей, изобретенной в 1890 г., используются и до сих пор во многих коммерческих дрожжерастительных установках.
2.2. Разведение дрожжей в сравнении с брожением
Пивоваренные дрожжи - факультативный анаэробный микроорганизм. Цель производственного процесса брожения -сбалансированное производство этанола и побочных продуктов, отвечающих за вкус пива. Совершенно другие задачи стоят при разведении дрожжей: они заключаются в получении достаточно чистой культуры дрожжей в оптимальном физиологическом состоянии, чтобы при определенном количестве введенных дрожжей, составе сусла и температурном режиме дрожжи могли бы последовательно, на протяжении ряда поколений сбраживать сусло в течение заданного времени и обеспечивать сенсорный профиль пива. Кислород абсолютно необходим для синтеза стеринов и ненасыщенных жирных кислот в процессе роста дрожжей.
Обмен веществ дрожжей в процессе их разведения и брожения различен, поскольку, как показано в (табл. 1), эти процессы характеризуются различными условиями протекания.
Почти все пивовары используют стандартное, приготовленное для сбраживания
сусло, которое выступает также в качестве среды для выращивания дрожжей. Для
роста дрожжей в процессе их размножения необходимы следующие питательные
вещества:
• источники азота: аминокислоты и пептиды;
• источники
углерода: сбраживаемые сахара;
• насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты,
стерины и липиды;
• витамины;
• необходимые ионы: Zn2+,
Mg2+, Cu2+, Ca2+, K+, ...;
•
кислород.
Солодовое сусло не идеальная среда для разведения дрожжей, это главным образом источник азота, что является сдерживающим фактором роста. Если на пивоваренном заводе не практикует добавку цинка, может наблюдаться и дефицит цинка. Для увеличения концентрации биомассы были предложены различные способы. Таиди и др. [3] добились повышения концентрации дрожжей до 290 млн клеток/мл, добавляя жидкий кукурузный экстракт со свободным аминным азотом в концентрации 10 г/кг. С помощью добавки дробленых ростков солода с концентрацией аминного азота 3,38 г/кг и концентрацией цинка 15 мг/100 г Метнер [4] получил конечную концентрацию 225 млн клеток/мл.
Большинство пивоваров не производят и не закупают специальную питательную среду, предназначенную для промышленного разведения дрожжей. Таким образом, перенос кислорода к дрожжевым клеткам остается основным показателем, который может быть оптимизирован.
2.3. Периодическое разведение дрожжей
Наиболее общий принцип разведения дрожжей, используемый в пивоваренной
промышленности, - периодическая система. Кривая роста дрожжей может быть
подразделена на три фазы: лаг-фазу, экспоненциальную и стационарную фазу. В
течение фазы экспоненциального роста популяция увеличивается с постоянной
скоростью. Таким образом, скорость увеличения биомассы (dX/dt) пропорциональна
количеству биомассы (X): dX/dt = цХ, где константа пропорциональности ц -
удельная скорость роста культуры. Это уравнение действительно только при
условии, что:
• нет недостатка в питательных веществах, необходимых для
роста;
• в питательной среде нет никаких веществ-ингибиторов роста;
•
посевной материал отличается высокой жизнеспособностью.
Скорость роста ц постоянна для данной среды, штамма дрожжей и условий размножения, и имеет значение, обратное времени (ч-1). Она часто выражается в значении времени удвоения td, необходимого для увеличения количества клеток в два раза. В (табл. 2) показано, как рассчитывается время удвоения.
3.1. Причины, обуславливающие необходимость создания новой системы разведения дрожжей
Многие существующие дрожжерастительные установки незначительно отличаются от аппарата Хансена и Кюле, разработанного в конце девятнадцатого столетия. На пивоваренном заводе в Хаахте (Бельгия), где смонтирована новая дрожжерастительная установка, имеется также традиционная система с устройством для аэрации кислородом, которая после приблизительно 3 дней разведения позволяет получить типичные концентрации дрожжей от 80 до 100 млн клеток в 1 мл. В этой системе воздух время от времени подается в сусло-дрожжевую суспензию, но это может быть объяснено тем, что для дрожжей в основном характерен бродильный обмен веществ. Так как пивоваренный завод также производит пиво, дображивающее в бутылках, существует высокий спрос на очень активные дрожжи, повышена потребность в коротком цикле выращивания дрожжей и необходимо как можно большее количество дрожжей находящихся в оптимальном состоянии.
Основная возможность совершенствования этих дрожжера-стительных аппаратов заключается в подаче кислорода в жидкую фазу. Машелейн и др. [1] показали эффективность подачи кислорода с помощью мембранного разбрызгивателя замкнутой конфигурации, используемого для насыщения кислородом снятых дрожжей. Эта методика адаптирована и оптимизирована для разведения культурных дрожжей.
3.2. Исходные условия
Использовался штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Время удвоения штамма в сусле при 20С в аэробных условиях в лаборатории - 5,0 часов, при этом удельная скорость роста М-0,139 ч-1.
Стандартное сусло с плотностью 11,5% было получено из 80% светлого солода и 20% кукурузных зерен. В сусловарочном отделении к нему было добавлено 0,2 ррт цинка в форме ZnS04.
Кислород использовался в баллонах, тип качества N45 производства компании Air Liquide.
3.3. Лабораторное выращивание: начальные условия
Чистый штамм дрожжей из поверхностной культуры размножался в лаборатории в три этапа. 25 мл образца поверхностной культуры при комнатной температуре высеивали последовательно в 250 мл и 2,5 л стерильного сусла пивоваренного завода и оставляли для разбраживания. На последней стадии дрожжи помещались в колбу Карлсберга, заполненную 18 л стерильного сусла. Воздух подавался в сусло в течение 1 часа перед введением дрожжей. В процессе размножения не применялось ни аэрирование, ни перемешивание. Конечная концентрация дрожжей в колбе Карлсберга была довольно низкой - обычно от 60 до 80 млн клеток/мл. На последовательность лабораторного выращивания нужно обращать особое внимание.
Интересная альтернатива классической колбе Карлсберга была предложена Болтоном и Куэйном [5]. Они обеспечивали высокую скорость подачи чистого стерильного кислорода через окалину нержавеющей стали при непрерывном перемешивании с помощью магнитной мешалки.
3.4. Промышленный дрожжерастительный аппарат
Производственная установка для разведения дрожжей представляет собой многососудную систему, состоящую peзервуара для разведения (пропагатора) вместимостью нетто 70 гл и резервуара-накопителя вместимостью 6 гл. Аппарат для разведения снабжен внешним контуром с мембранным разбрызгивателем. Если Машелейн и др. [1] использовали мембрану с размером пор 0,5 мкм, то при использовании слойной мембраны с размером пор меньше 0,05 мкм передача кислорода еще более увеличивается. Полная удельная поверхность мембран из спеченной окиси алюминия - 2,5 м2 для все) установки. В процессе выращивания дрожжей в мембранах поддерживается давление, направляющее поток кислорода на встречу потоку дрожжевой суспензии (рис. 1).
В мембранном контуре измеряются и контролируются те пература, растворенный кислород и скорость потока кислор да. Хотя при стандартных операциях в этом нет необходимости дополнительно на выходе из аппарата для разведения дрожжей смонтирован зонд для отбора проб кислорода. На (рис. 2) показан принцип действия системы.
На первом этапе аппарат для разведения дрожжей (70 ml заполняют 4 гл холодного сусла. Сусло пастеризуют при 95°С в течение 20 минут и охлаждают до 21°С с помощью выносных теплообменников. Как только температура достигнута, в суш вводят дрожжи из колбы Карлсберга, открывая вентиль подачи семенных дрожжей. По достижении концентрации между ЮОи 140 млн клеток/мл, 4 гл дрожжевой суспензии передают в накопитель дрожжей (6 гл). После мойки и стерилизации аппарат для разведения дрожжей заполняют 60 гл холодного сусла и пастеризуют. Потом в сусло перекачивают 4 гл дрожжей из накопителя и начинают процесс разведения.
В процессе размножения дрожжей в мембранах поддерживают давление кислорода в 3 бара, после инжекции уровень ки слорода составляет 7 ррm. Измеритель кислорода снабже( датчиком тревоги, который перекрывает подачу кислорода, ко гда его уровень поднимается выше, чем 12 ррm. Мембран (размер пор - 0,05 мкм) гарантируют стерильную подачу кисл рода в течение всего процесса размножения. В аппарате для разведения дрожжей максимальное давление составляет 0,1 бара. Дрожжевая суспензия циркулирует с такой скоростью! что содержание кислорода на выходе из аппарата составляет около 0,5 ррm. Эту концентрацию кислорода обеспечивает скорость циркуляции 5 оборотов в час.
После начала процесса выращивания дрожжей последующие циклы разведения могут
начинаться с 4-6 гл дрожжей, которые остаются в дрожжевом накопителе. При таких
условиях установка функционировала почти непрерывно в течение более чем двух
лет, новая культура из лаборатории использовалась приблизительно каждые 4
месяца.
(Рис. 3.
Разведение дрожжей в 64 гл сусла с содержанием аминного азота 160
ppm)
( Рис. 4.
Разведение дрожжей в 64 гл сусла с содержанием аминного азота 220 ррm)
3.5. Результаты На первом этапе промышленного разведения дрожжей после смешивания 4 гл сусла с содержимым колбы Карлсберга наблюдалась довольно низкая концентрация дрожжей - от 2,5 до 3 млн клеток/мл. Через 24 часа обычная концентрация дрожжей составляла от 100 до 140 млн клеток/мл.
После этого все содержимое перекачивалось в аппарат-накопитель меньшего объема и охлаждалось до 4°С с помощью рубашек охлаждения между 2° и 4°С, а затем выдерживалось максимум в течение 8 суток. На рис. 3 показан результат разведения дрожжей в 64 гл сусла. Концентрация аминного азота в сусле составляет 160 ррm.
Через 24 часа конечная концентрация дрожжей составила приблизительно 133 млн клеток/мл с сухим весом 8 г/л. Кислородный баллон был взвешен, общий расход кислорода был равен 14,2 кг. Скорость потока кислорода составляла от 2 до 10 л в минуту. Пробы, взятые на завершающей стадии размножения, показали уровень аминного азота ниже чем 50 ррт (неточные измерения). Для увеличения конечной концентрации клеток использовалось сусло из 100 % солода и содержанием аминного азота 220 ррт. Результаты представлены на рис. 4. Через 33 часа конечная концентрация составляла приблизительно 230 млн клеток / мл, что значительно выше достигнутых ранее показателей.
4.1. Аэрирование или насыщение кислородом
И аэрирование, и насыщение кислородом в процессе размножения дрожжей имеют целью снабжение клеток достаточным для производства биомассы количеством кислорода. Использование воздуха имеет несколько недостатков по сравнению с кислородом. Растворимость кислорода в сусле (11,5%) при аэрировании - 8,0 мг 02/л, а при насыщении кислородом - 38,5 мг 02/л [6]. Низкая растворимость кислорода при аэрировании вкупе с улетучиванием (stripping effect) 78% азота значительно затрудняют подачу кислорода к жидкой фазе. Другой проблемой при использовании воздуха является пенообразование, вызванное азотом, из-за чего требуется аппарат со свободным пространством над продуктом. Однако определенное количество С02 образуется даже при насыщении сусла кислородом и при аэробных условиях, что приводит к образованию пены на уровне приблизительно 1 метра над жидкой фазой. Это вызвано эффектом Грабтри (то есть хорошо сбраживаемые углеводы предотвращают дыхание). С другой стороны, насыщение сусла кислородом может приводить к высоким концентрациям кислорода, которые вызывают у дрожжевой клетки стресс и могут привести даже к гибели клетки [7]. Дозирование кислорода необходимо контролировать, и мембранная система разбрызгивателя выполняет эту функцию.
У клеток измерялась только жизнеспособность (минимум 98%), а не жизненность. Не было зафиксировано никаких проблем, предполагающих возникновение у дрожжей кислородного стресса. Брожение начиналось сразу же после введения свежевыращенных дрожжей.
При размножении в сусле, приготовленном с использованием 80% солода, общий вес биомассы составил: 6,4м3 х 8 кг сухого вещества/м3 = 51,2 кг свежих дрожжей.
Аннемюллер и Мангер [3] считают, что потребность дрожжей в кислороде в процессе размножения составляет около 120 мг кислорода на 1 г сухого вещества. Учитывая эти данные, для формирования биомассы необходимо: 51,2 кг дрожжей х 0,12 кг кислорода/кг сухого вещества = 6,14 кг кислорода. Всего было использовано 14,2 кг кислорода. Это значит, что приблизительно 45% потребленного кислорода ушло на производство биомассы. Остальная часть использованного количества кислорода, вероятно, химически окисляет среду выращивания или частично удаляется небольшим количеством присутствующего углекислого газа.
4.2. Кинетика роста дрожжей
В табл. 2 показан расчет времени удвоения td, который действителен в том случае, если нет никаких ограничений в субстрате. Если предположить, что дрожжи для разведения и сусло, полученное из 80% солода, с 8 часов (концентрация 20 млн клеток/мл) до 22 часов (концентрация 128 млн клеток/мл) находятся в экспоненциальной фазе, тогда время удвоения td = (22-8) • In2/(ln128-ln20) = 5,23 часа. Это значение близко к времени удвоения, равному 5,0 ч, полученному в лаборатории при чисто аэробных условиях. Это говорит о том, что достаточное количество кислорода клетки получают до конца экспоненциальной фазы.
Было проведено несколько подобных циклов размножения. 64 гл дрожжей вырастали за 24-32 часа, т.е. гораздо быстрее сравнении с классической системой, где для этого необходимо от 72 до 96 часов.
4.3. Состав сусла Результаты показывают, что в процессе размножения дрожжей нет недостатка в источниках углерода. На завершающей стадии роста дрожжей плотность сусла составляет около 6°Р. Это ясно свидетельствует о том, что сусло пивоваренного завода - среда, произведенная для целей брожения. При алкогольном брожении в процессе гликолитического цикла (реакции Эмбдена-Мейерхофа-Парнаса) на 1 моль глюкозы образуется 2 моля АТФ. Количество АТФ при аэробном метаболизме намного выше. В ходе цикла лимонной кислоты образуются три молекулы НАДФ и одна ФАДФ2 на одну молекулу ацетилкоэнзима А. Они могут по дыхательной цепи образовывать 32 моля АТФ на моль глюкозы, и, таким образом, для получения энергии в процессе размножения требуется меньшее количество сбраживаемых Сахаров. Относительно высокая концентрация сбраживаемых Сахаров также объясняет образование углекислого газа вследствие эффекта Грабтри.
Что касается источника азота, то содержание свободных аминокислот имеет важное значение. Сравнение результатов разведения дрожжей на различных партиях сусла показывает важность свободного аминного азота: концентрация клеток дрожжей может увеличиваться на 60-70%.
4.4. Особенности роста дрожжей
Надо отметить, что на ряде графиков, отражающих рост дрожжей, зафиксировано падение скорости размножения дрожжей на протяжении нескольких часов сразу после 8 часов и следующее падение спустя еще 8 часов. Возможно, что спустя приблизительно 8 часов клетки находятся в G1 фазе цикла деления клеток, в которой клетки готовятся к отделению почки. Это вынуждает предположить, что на момент введения дрожжей в сусло почти все дрожжевые клетки находились в одной и той же фазе, что вряд ли возможно.
Другое объяснение предполагает изменение в метаболизме дрожжей. Это происходит при концентрации клеток приблизительно от 60 до 70 млн клеток/мл и экстрактивности сусла от 9,5° до 10°Р. Это изменение может быть вызвано высокой концентрацией сбраживаемых Сахаров, из-за чего некоторые к. ки начинают сбраживать (эффект Грабтри). Также возм что аминокислоты групп А и В уже поглощены, и начинается абсорбция аминокислот группы С, для которой необходимо присутствие пермеазы аминокислот.
Более вероятная причина состоит в том, что глюкоза, cодержащаяся в сусле, была использована клетками дрожжей, г чинается потребление мальтозы и мальтотриозы, которое бует присутствия пермеаз.
Дрожжерастительная установка функционировала практически непрерывно в течение более чем двух лет и соон ствовала всем требованиям в отношении количества кле-качества задаточных дрожжей (жизнеспособность, жизн) ность и стерильность) и необходимого для размножения в мени. Почти каждую неделю, во вторник в полдень, циклр множения начинался с 4 гл дрожжей, а конечный объем ( симум 70 гл) был готов для введения в четверг утром. Процесс размножения происходил полностью в аэробных условиях, а дрожжи использовались как для главного брожения, так и для брожения в бутылках. Дрожжи могут использоваться в бродильных резервуарах вместимостью до 1600 гл cусла Готовое пиво соответствовало всем спецификациям.качес пивоваренного завода.
Подобные установки работают со штаммами низовых дрожей, при этом нет никаких
значимых различий в протека процесса.
www.propivo.ru
На предыдущую