Габриела Басаржова, Мартин Блага, Петр Веселы, Институт химии бродильных производств и биоинженерии, Химико-технологический институт, Прага
Свойства штамма дрожжей наряду с качеством сырья и технологическими условиями отвечают за вкусовые особенности пива, а также за его так называемую природную коллоидную стабильность. В процессе брожения дрожжи образуют ряд типичных основных веществ букета пива, таких как эфиры, высшие спирты и жирные кислоты. Отдельные штаммы отличаются разными генетическими особенностями в отношении образования этих веществ, а также в отношении способности к изменению метаболических путей их образования в зависимости от условий производственного процесса. Влияние дрожжей на коллоидную и сенсорную стабильность пива, связано с метаболизмом серосодержащих соединений, результатом которого является образование диоксида серы. Сохранению свежего вкуса пива в течение срока его хранения способствует также ферментативная активность дрожжей, позволяющая окислить карбонильные вещества сусла. В обоих случаях речь идет о свойствах, которые могут различаться у отдельных штаммов как генетически, так и под влиянием их чувствительности к условиям брожения. Диоксид серы вследствие своих антиоксидантных и восстановительных свойств в значительной степени предохраняет пиво от отрицательного влияния растворимого кислорода и ряда карбонильных соединений. Он способен ингиби-роватьхемилюминисценцию, и, следовательно, способен «захватывать» активный кислород, тем самым замедляя окислительные реакции. Уровень диоксида серы в пиве находится в пределах до 20 мг/л, обычно же он составляет менее 15 мг/л. Концентрация выше 30 мг/л, которая обычно на практике не встречается, уже может повредить вкусовым особенностям пива. Образование диоксида серы в значительной мере зависит от генетических свойств используемого штамма дрожжей. Его концентрацию повышает также более высокое значение рН сусла, содержание серосодержащих аминокислот и сульфатов в сусле и, согласно мнению некоторых авторов, более высокая концентрация семенных дрожжей. Низкие значения диоксида серы обуславливаются интенсивной аэрирацией и высокой концентрацией ненасыщенных липидов в сусле.
Штаммы дрожжей отличаются разной способностью к восстановлению карбонильных соединений сусла, образующихся уже в процессе соложения и варки, чаще всего в результате взаимодействия аминокислот и Сахаров (реакция Майяра), разщепления аминокислот по Штреккеру и ферментативного и неферментативного распада липидов. Эти альдегиды являются субстратами для редуктаз дрожжей, которые превращают их в спирты. Известны две ферментативные системы такого рода: алкогольредуктаза, катализирующая восстановление пентанала и пентенала, и аль-доредуктаза, специфичная для 3-метилбутанала и пентанала. Для характеристики отдельных редуктаз этого типа в работах нашего института был разработан и усовершенствован метод очистки дрожжевой НАДФ-3-метилбутаналредук-тазы, и с помощью электрофореза доказано существование двух дрожжевых НАДФ-редуктаз, специфичных для 3-метилбутанала. В настоящей статье представлены результаты исследования свойств трех штаммов дрожжей, используемых на чешских пивзаводах, с точки зрения образования ими диоксида серы и активности редуктаз альдегидов и связи этих факторов с различиями в кривых роста, степени гидрофобности и абсорбции аминокислот. Также был исследовано влияние штамма дрожжей на изменение окислительно-восстановительной способности сусла и изменение концентрации полифеноль-ных соединений в сбраживаемом сусле.
Эксперименты по моделированию брожения проводились в течение трех лет в 10-литровых бродильных цилиндрах с 10%-ным и 12%-ным светлым суслом (суммарный объем сусла 35 л), которое всякий раз бралось на одном чешском пивзаводе. Примеры приведенных в публикации результатов взяты на основании данных опытных циклов сбраживания 12%-го сусла, для которых были обеспечены абсолютно сходные технологические условия, т.е. одинаковый состав сусла, аэрирование (8,0 мг/02), главное брожение проводилось всегда при температурах 7°С, 10°С и 13°С, одинаково используемые дро-жии и хмель физиологическое состояние и концентрация дрожжей в сусле (10 млн клеток/мл) была одинаковой. Поэтому установленные различия в результатах анализов можно приписать генетическим различиям исследованных штаммов.
Исследовались три штамма дрожжей, которые в коллекции VUPS (Прага) обозначены
как:
1) штамм №2 - сбраживание от среднего до глубокого, хорошее оседание,
2) штамм №7 - средне-сбраживающий, очень хорошее оседание,
3) штамм №95
- глубоко-сбраживающий, хорошее оседание.
Принцип
При переносе водорода кофактором НАДФ возникает ароматический характер его пиримидинового ряда, и в связи с этим характерно меняется абсорбция в УФ-диапазоне.
Оборудование и инструменты
Спектрофотометр Shimadzu UV 2100, кремниевая кювета шириной 1 см.
Дезинтегратор Bio Neb.
Растворы
Смесь Тритон-альдегид: 7,5 мл 0,1 М МЕЗ (2-(М-морфоли-но)этансульфоновая кислота) рН 7,0, 300 мкл Тритон, 100 мкл 3-метилбутанала, 16,8 мл дистиллированной воды, 8,3 мг НАДФ в 1 мл дистиллированной воды, 100 мМ b-сульфанилэтанола.
Подготовка образцов
Из бродильного цилиндра было взято 1000 мл разброженно-го сусла, из которого центрифугированием при 1000 об./мин. была получена часть густых дрожжей. Дрожжи в количестве 1 г ресуспендировались 0,1 М МЕЗ в буферном растворе с рН 7,0, содержавшем 1 мМ р-сульфанилэтанола, 1 мМ фенилметил-сульфонил флуорида и 0,2 мМ сорбитола, и смесь перемешивалась в дезинтеграторе высокого давления. Для дальнейшей работы использовался супернатант, полученный центрифугиро нием в течение 20 минут при 10 000 об./мин.
Рабочий метод
В кремниевую кювету шириной в 1 см с помощью пипетки были помещены: 1,5 мл раствора Тритон-альдегида, 30 мш фактора НАДФ, 30 мкл 100 мМ b-сульфанилэтанола, 1 млд тиллированной воды и 0,5 мл дрожжевого супернатанта.
Ультрафиолетовым спектрофотометром измерялась а сорбция при 340 нм в течение 4 минут.
Расчет и оценка результатов
Итоговая активность 3-метилбутаналредуктазы выражалаись в мкмоль кофактора НАДФ, окисленного в течение часа, в расчете на мг белка, количество которого в дрожжах было определено методом Фолина.
Дрожжевые полисахариды определялись методом экстракции по Тревеляну и Харрисону, гликоген - измерением флюоресценции акрифлавина, гидрофобность клеточных поверхностей - по Хинклиффу и др., окислительно-восстановительная способность сбраживаемого сусла - по Канед, Шапону и МЕВАК, гистограммы размера (РSС) и гранулярности (SSС) - проточным цитометро РАРТЕС-РА8-Ш. Кривая роста, определение диоксида серы дистилляцш определение общих, окисленных, окисляемых полифенолов антоцианогенов, отдельных аминокислот на автоматическо анализаторе Т339 проводилось согласно стандартным опю ным методам.
Образование дрожжевыми штаммами вторичных метаболи тов и уровень ферментативной активности в процессе броже] ния тесно связаны с генетически обусловленной способное к метаболизму, проявляющейся в скорости и степени размно жения клеток, а также в способности к оседанию. Эти свойствa относятся к наследственным признакам клеточной популяции,
Кривая роста для дрожжевого штамма №7 по сравнению с штаммом №2 и №95 отличалась более короткой лаг-фазой, более бурной фазой экспоненциального роста с более ранним, но более низким максимумом количества клеток в фазе роста, более ранней агглютинацией и седиментацией (рис. 1,2). Штаммы №2 и №95 достигли максимума на кривой роста в одно и то же время брожения. У штамма №2 при различных условиях брожения максимум на кривой роста был неизменно выше, а оседание, характеризующееся уменьшением количества клеток в фазе роста, значительнее, чем у штамма №95.
Эти различия в характере кривых роста сравниваемых штаммов соотносятся с различиями гистограмм размера (РSС) и гранулярности (SSС) клеток. Гистограмма отражает зависимость данной величины от количества клеток, прошедших через кювету проточного цитометра за данное время.
На гистограмме размера клеток в течение 72-го часа брожения (рис. 3) у штамма №7 видно появление двух максимумов, тогда как у штамма №2 и №95 пик только один. Это доказывает, что в данное время брожения у штамма №7 присутствовали две субпопуляции. Клетки большего размера, т.е. клетки с почкой, представлены максимумом, лежащим правее на горизонтальной оси. Гистограммы гранулярности отражают свойства клеточных поверхностей, например, неровность поверхности вследствие образования рубцов после почкования. В течение 72-го брожения на гистограмме (рис. 4) самое низкое среднее значение пика можно наблюдать прежде всего для штамма №2, что свидетельствует о меньшем количестве делящихся клеток в данное время по сравнению прежде всего со штаммом №7.
Все дрожжи низового брожения Saccharomyces uvarum в отношении взаимодействия между средой и поверхностью клеток отличаются в принципе гидрофильным характером. Дрожжи верхового брожения Saccharomyces cerevisiae имеют гидрофобные свойства. Индекс гидрофобности НI представляет собой отношение между значениями абсорбции водной и углеводородной фазы с дрожжевой популяцией, измеренное при 660 нм. Для дрожжей верхового брожения НI менее 50%, для «низовых» дрожжей - выше 50%.
Измерение гидрофобности подтвердило, что штаммы №2, №7 и №95 принадлежат к группе гидрофильных микроорганизмов, так как полученные значения НI были больше 50% (рис. 5). Однако оказалось, что и для штаммов низового брожения существует тенденция к адгезии некоторых клеток к пузырькам углекислого газа, а часть дрожжей поднимается после добавки органических веществ (гексана, изооктана, диэтилэфира и т.д.). В этом отношении максимальной тенденцией к гидрофобности отличался штамм №95, что соотносится с его худшей способностью к оседанию по сравнению со штаммом №2 и, прежде всего, со штаммом №7.
Согласно сегодняшним представлениям, способность к флокуляции и оседанию у низовых дрожжей обусловлена генетически. Однако на нее влияют также свойства среды культивирования и метаболическая активность дрожжей. К факторам, влияющим на флокуляцию и оседание дрожжей, а тем самым и на степень их метаболической активности, относятся изменения содержания полисахаридов в клеточных сте ках, прежде всего маннана (рис. 6), в меньшей степенипи кана (рис. 7). Обычно считают, что хуже флокулирующие и оо дающие пылеводные дрожжи имеют в клеточных стенк больше маннана, чем хорошо оседающие дрожжи. Различия содержании маннана в клеточных стенках исследованш штаммов дрожжей и его изменения в процессе брожения были незначительны, что связано с тем, что при одних и тех же условиях способность дрожжей к оседанию не особенно ото чалась (рис. 6). В начале процесса брожения содержание ма нана быстро снизилось, потом последовал его увеличение дальнейшее снижение. Начало флокуляции и оседания соо ветствовало, согласно данным, приводимых в специальной литературе, тому моменту брожения, когда содержание маг нана в клеточных стенках был самым низким. Штамм №7 отличался тем, что у него максимум содержание маннана в клето ных стенках в процессе брожения был достигнут раньше, чем у штаммов №2 и №95. После достижения максимума у штамма №7, наоборот, наблюдалось резкое снижение количестве маннана, тогда как у двух других исследованных штаммов ег количество уменьшалось медленнее. По-видимому, с этим определенной степени связаны также установленные умерен ные различия во времени и скорости оседания штамма №7 сравнению со штаммами №2 и №95.
исследованных штаммов дрожжей в процессе брожения
Основным резервным веществом, которое дрожжевая клетка использует для получения энергии, необходимой (особенно в начале роста) для размножения и метаболической деятельности, является гликоген. Методом экстракции во всех экспериментах для штамма №7 был получен несколько более высокий по сравнению со штаммами №2 и №95 уровень содержания клеточных резервных полисахаридов, в особенности гликогена (рис. 8), а также и дисахарида трегалозы (рис. 9). У всех трех штаммов содержание гликогена в процессе брожения сначала уменьшалось, а потом опять увеличивалось в результате синтеза гликогена клетками. Это было подтверждено и с помощью метода, основанного на принципе измерения флуоресценции акрифлавина, значения которого соответствовали концентрации гликогена в клетках [17] (рис. 10). Штамм №7 в течение первых 48-72 часов брожения проявил тенденцию к более значительному потреблению гликогена, а затем - к более интенсивному его синтезу, что при повторном использовании семенных дрожжей обуславливает более быстрое размножение дрожжей, так как в лаг-фазе в распоряжении клеток имелся богатый источник энергии для синтеза стеринов и жирных кислот.
Дрожжи абсорбируют аминокислоты сусла постепенно. Отдельные их группы могут быть использованы ими только после снижения до определенного значения содержания потребленных ранее соединений, прежде всего треонина и серина.
Нами уже были опубликованы работы, посвященные различиям штаммов, в том числе штаммов №2 и №7, в отношении абсорбции ими аминокислот сусла. Полученные ранее результаты еще раз подтвердились при исследовании штаммов, о которых идет речь в данной статье. Дрожжи штамма №7, размножающиеся быстрее, отличаются повышенным синтезом тех аминокислот, которые он в необходимый момент еще не могут получить из сусла, прежде всего разветвленных аминокислот, таких как валин. Этим объясняется тенденция к повышенному образованию диацетила у пива, полученного с использованием штамма №7, так как его клетки выделяют в сбраживаемую среду большее количество промежуточных продуктов синтеза валина - а-ацетолактата - по сравнению с другими исследованными штаммами. Выделенный а-ацетолактат неферментативным путем превращается в диацетил.
Уменьшение количества валина на 50% от исходного количества в 12%-ном сусле в процессе брожения при 10°С было характерно для штамма №95 на 40-м часу брожения, для штамма №2 - на 45-м часу и для штамма №7 - на 48-м часу брожения. Для штамма №7 была отмечена более низкая скорость и меньшая степень абсорбции всех аминокислот сусла. В определенной степени это может повлиять на содержание остаточных аминокислот в пиве, полученном с данным штаммом. В процессе пастеризации и хранения для такого пива можно предполагать возникновение большего количества так называемых компонентов старого вкуса пива типа альдегидов, образующихся после распада аминокислот.
Образование диоксида серы зависит от ряда факторов, влияющих на рост и физиологическое состояние дрожжей. Решающее влияние штамма дрожжей уже было нами доказано ранее. Максимальное образование S02 было характерно для всех трех штаммов по достижении максимума кривой роста (рис. 11). Затем следовало плавное снижение, обусловленное, с одной стороны, взаимодействием с карбонильными соединениями, с другой - возможным вместе с углекислым газом в бродильные газы.
Не существует единой точки зрения на влияние температуры брожения на образование диоксида серы [40, 41]. Ушида и Оно [42] считают, что влияние температуры проявляется по-разному в зависимости от штамма и от физиологического состояния дрожжей. Согласно Канеде и др. образование S02 уменьшается с увеличением температуры брожения, тогда как Нордлов [40] утверждает, что оптимальная температура брожения для образования S02 колеблется между 14° и 16°С. Применение давления в начале процесса брожения подавляет рост дрожжей и ускоряет образование S02.
В более ранних и данных исследованиях нами был установлено, что с увеличением температуры брожения (исследования проводились при температуре 7°С, 10°С, 13°С, 18°С) у всех трех штаммов - №2, №7 и №95 - увеличивался максимум образования S02, но более интенсивным было и последующее его снижение, как это видно на примере брожения со штаммом №2 при двух температурах (рис. 12).
В отличие от других авторов, утверждающих, что при более высокой концентрации семенных дрожжей образование S02 несколько увеличивалось, мы ни у одного из исследоЕ нами штаммов не отметили видимого различия при концентрации дрожжей от 10 до 25 миллионов клеток на мл (рис. 13)
На образование S02 значительно влияет физиологии состояние дрожжей. Голодание или старение дрожжей перед введением в сусло увеличивает образование S02. В про старения клеток снижается уровень гликогена в клетках, релл и др. установили, что существует зависимость его содержанием в семенных дрожжах и уровнем S02 к брожения. Факторы, способствующие исчерпанию запасо когена, например, повышение температуры или срока хранения семенных дрожжей, приводят к увеличению образования S02.
При разных условиях брожения наибольшее интена образование S02 был характерен для штамма №2, неш менее интенсивное - для штамма №95 и самое слабое - штамма №7, которому была свойственна тенденция к бол му содержанию гликогена в клетках.
Так как во всех экспериментах сравнивались штаммы с наковым физиологическим состоянием, различия в образов S02 можно приписать разным генетическим свойствам исследованных штаммов дрожжей в отношении использование серы.
Диоксиды серы являются промежуточными веществами при превращении серы до серосодержащих аминокислот тионина и цистеина. Источниками серы для дрожжевой кл являются неорганические сульфаты, поставляемые в кл пермеазой и превращающиеся с помощью АТР-сульфури; (АТР, ЕС 2.7.7.4) в аденилсульфат (АРS), а далее при учаcnbb АРS-киназы на фосфоаденилсульфат (РАРS), который в с очередь превращается под воздействием диоксида серы РАРS-редуктазы. Под действием сульфитредуктазы (S-R, ЕС 1.8.9 диоксид серы восстанавливается до сульфда, использую гося дрожжами при синтезе цистеина, метионина и S-аденносилметионина (SАМ). Последнему присуща транскрипция бс шинства генов, если не всех, отвечающих за использование ры. Способ использования серы запрограммирован ме болически и генетически. Из этого следует, что выделее дрожжами сульфитов может быть вызвано несбалансировансированностью образования и потребления диоксида серы или его вз; модействием с другими соединениями. Их накопление вдрс жевой клетке может привести к проникновению свободной связанного диоксида серы через цитоплазматическую мембрану в сбраживаемое сусло. Брюер и Фентон установили, что в момент максимального образования SO2 отношение активности АРS и сульфитредуктазы в три-шесть раз ниже у штаммов с низким образованием SO2, чем у штаммов с высоким образованием SO2. Другой причиной снижения количества сульфитов является образование соединений с ацетальдегидом. Вследствие этого возникает недостаток метионина и активируется абсорбция и восстановление сульфата [39]. Активно сбраживающая дрожжевая клетка выделяет сульфиты. Это выделение прекращается в конце брожения, когда исчерпываются источники энергии для изменения сульфата. В начале брожения выделение сульфитов начинается после лаг-фазы и быстро увеличивается до тех пор, пока метионин из среды не будет исчерпан почти полностью. Самое значительное увеличение происходит между лаг-фазой и концом брожения. Пока продолжается размножение дрожжей, высока потребность в серосодержащих аминокислотах, а выделение сульфитов остается на низком уровне. Как только размножение дрожжей заканчивается, первая часть цепочки, которая ведет к превращению сульфата в диоксид серы, все еще активна, тогда как снижение потребности в серосодержащих аминокислотах и более низкая активность сульфитредуктазы способствуют накоплению и выделению S02, пока присутствует сбраживаемый экстракт. Поэтому в среду попадает тем больше сульфитов, чем больше экстракта сброжено после окончания фазы размножения.
Штамм №7 из-за бурного размножения клеточной популяции в экспоненциальной фазе исчерпывает энергетический потенциал, и после достижения максимума кривой роста агглютинируется и осаждается раньше, чем штаммы №2 и №95. Поэтому в этой фазе он не способен в той же степени сбраживать оставшийся экстракт, и образование SO2 у него ниже. Кроме того, у исследованных штаммов, по-видимому, будут несколько отличаться и генетические характеристики, ответственные за инициацию соответствующих ферментов в метаболизме серосодержащих соединений, что подробно описано, например, в печатной версии дипломной работы, сделанной в Химико-технологическом институте.
Фермент 3-метилбутаналредуктаза позволяет популяции дрожжей восстанавливать альдегиды. При одной и той же температуре брожения самую высокую активность фермента 3-метилбутаналредуктазы проявил штамм №2, самую низкую -штамм №7 (рис. 14). Эта активность достигала своего максимума в фазе экспоненциального роста дрожжевых клеток, потом отмечалось постепенное снижение. На примере сбраживания штаммом №2 видно, что активность редуктазы увеличилась при температуре брожения 13°С по сравнению с брожением при температуре 10°С, но последующее снижение в результате более быстрого ингибирования ферментативной активности было более значительным (рис. 15). При температуре брожения 7°С различия в активности 3-метилбутаналредуктазы у всех трех штаммов были незначительны в процессе всего брожения, активность в целом была ниже, но тенденции к ее увеличению и снижению сохранялись.
Показатель оксилительно-восстановительной способности характеризует состояние сусла или пива с точки зрения его устойчивости к окислительным изменениям некоторых веществ экстракта. Он указывает на то или иное отношение соединений в окисленной и восстановленной форме соответствующих обратимых реакций. Шапон и Крецчмер показали, что существует определенная связь между восстановительной способностью и коллоидной и сенсорной стабильностью пива. Ушида и Оно считают, что сенсорная стабильность пива определяется эндогенной антиоксидантной способностью, на которую влияет каждый этап пивоваренного процесса, начиная от сырья и кончая розливом пива. Результаты определения окислительно-восстановительного потенциала сусла, параллельно сбраживаемого штаммами №2, №7 и №95, по методам Канеды, Шапо-на и МЕВАK, каждый из которых регистрирует разные группы веществ, не показали влияния штамма дрожжей на данный показатель ( рис. 16,17,18). Не было установлено и значительного влияния температуры брожения. Рост окислительно-восстановительной способности в течение первых 28 ч брожения связан с ростом биомассы и потреблением растворимого кислорода суслом.
Полученные результаты показали, что решающее влияние на окислительно-восстановительные свойства пива оказывает доля соединений в восстановленной форме, по происхождению связанных с сырьем, т.е. солодом и хмелем, и их изменения, вызванные условиями технологического процесса.
В физико-химических и сенсорных свойствах пива полифе-нольные соединения играют как значительную положительную, так и отрицательную роль. Окисленные полифенолы в результате различных реакций способствуют образованию коллоидных осадков, а также «старого» вкуса пива. Напротив, восстановленные формы способствуют длительному сохранению прозрачности и «свежему» вкусу пива.
Выпадение из раствора нестабильных, прежде всего окисленных полифенолов и их удаление в процессе охлаждения сусла и сбраживания является одной из предпосылок повышения устойчивости пива к образованию коллоидных осадков и к сенсорным изменениям. Процесс осветления в значительной степени зависит от изменений рН и окислительно-восстановительной способности сбраживаемой среды. Эти факторы, наряду с технологическими условиями, также зависит от свойств использованного штамма дрожжей.
На основе проведенных опытных циклов брожения можно судить о влиянии температуры на снижение содержания с полифенолов. При более высокой средней температуре ного брожения наблюдался более значительное снижем держания общих полифенолов. Тот же вывод можно еде; для снижения содержания окисленных полифенолов в пр се брожения. Снижение содержания окисленных полифе при температуре брожения 13°С достигало около 80% от и центрации в исходном сусле. Не подтвердилось влияние пературы брожения на изменения окисляемых полифен Не было установлено существенного различия в отншении снижения содержания исследованных групп полифенольных соединений при сбраживании штаммами №2, №7 и №9 одних и тех же технологических условиях, что говорит о то особенности использованного штамма дрожжей не играю чительной роли в процессе снижения уровня полифенольных соединений в процессе брожения.
Правильный выбор штамма дрожжей и его физиолс ское состояние влияют не только на плавность протекани нологического процесса и достижение основных химичес биохимических показателей и типичного букета данного пива, но могут также замедлить образование коллоидных осадков и сенсорных изменений продукта в процессе его хранения.
www.propivo.ru
На предыдущую